背景技术：
1、依赖性细小病毒，例如腺相关依赖性细小病毒，例如腺相关病毒(aav)，作为用于将各种有效载荷递送至细胞(包括在人类受试者中)的载体而受到关注。
技术实现思路
1、本公开部分地提供了改进的变体依赖性细小病毒衣壳蛋白(例如aav2的变体)、如vp1、vp2和vp3衣壳蛋白，产生依赖性细小病毒的方法，用于其的组合物，以及由其产生的病毒颗粒。在一些实施例中，与衣壳蛋白中没有突变的病毒颗粒相比，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒具有增加的眼部生物分布和/或转导。本公开进一步提供了变体衣壳多肽和包含此类变体衣壳多肽的病毒颗粒，其在静脉内施用后令人惊奇地转导眼部组织(例如，视网膜组织)，并且特别地，在静脉内施用后转导眼部组织的程度远高于不具有本文所述的突变的其他方面相似的病毒颗粒。
2、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含编码如本文所提供的变体衣壳蛋白的序列的核酸。在一些实施例中，依赖性细小病毒是腺相关依赖性细小病毒(aav)。在一些实施例中，aav是aav2，例如aav2的变体。
3、在一些实施例中，本公开部分地涉及本文所述的衣壳多肽。
4、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的核酸的依赖性细小病毒颗粒。
5、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的核酸的载体，例如质粒。
6、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的核酸(例如，包含编码衣壳多肽，如vp1的序列的核酸)的依赖性细小病毒颗粒，其中编码序列包含如本文所提供的改变或突变。
7、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含变体衣壳多肽的依赖性细小病毒颗粒，该变体衣壳多肽包含与seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的vp1、vp2或vp3序列具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％同一性的多肽。
8、在一些实施例中，本公开部分地涉及核酸分子，该核酸分子包含seq id no:5、seqid no:6或seq id no:7，其片段，或其与其具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的变体。
9、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的核酸(例如包含编码衣壳多肽(例如vp1多肽)的序列的核酸)的载体，其中编码序列包含如本文所提供的改变或突变。
10、在一些实施例中，本公开部分地涉及细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含本文所述的核酸或载体，该核酸或载体例如包含编码衣壳多肽(如vp1)的序列，其中衣壳多肽编码序列在编码序列中包含如本文所提供的改变或突变。在一些实施例中，细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含本文所述的依赖性细小病毒颗粒，例如，其中该颗粒包含核酸，该核酸包含编码衣壳多肽(如vp1多肽)的序列，其中编码序列包含如本文所提供的改变或突变。
11、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的多肽的细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其中多肽编码序列包含如本文所提供的改变或突变。在一些实施例中，细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含本文所述的依赖性细小病毒颗粒，例如，其中该颗粒包含核酸，该核酸包含编码vp1多肽的序列，其中vp1编码序列包含如本文所提供的相应的改变或突变。
12、在一些实施例中，本公开部分地涉及一种将有效载荷递送至细胞的方法，该方法包括使细胞与包含本文所述的核酸的依赖性细小病毒颗粒接触。在一些实施例中，本公开部分地涉及一种将有效载荷递送至细胞的方法，该方法包括使细胞与包含本文所述的衣壳多肽的依赖性细小病毒颗粒接触。
13、在一些实施例中，本公开部分地涉及一种制备依赖性细小病毒颗粒的方法，该方法包括：提供细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含本文所述的核酸(例如，包含编码如本文所提供的aav2衣壳变体的序列的核酸)；以及在适合于产生依赖性细小病毒颗粒的条件下培养细胞、无细胞体系或其他翻译体系，从而制备依赖性细小病毒颗粒。在一些实施例中，本公开部分地涉及一种制备本文所述的依赖性细小病毒颗粒的方法。
14、在一些实施例中，本公开部分地涉及一种制备依赖性细小病毒颗粒的方法，该方法包括：提供细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含本文所述的多肽；以及在适合于产生依赖性细小病毒颗粒的条件下培养细胞、无细胞体系或其他翻译体系，从而制备依赖性细小病毒颗粒。在一些实施例中，本公开部分地涉及一种制备本文所述的依赖性细小病毒颗粒的方法。
15、在一些实施例中，本公开部分地涉及在细胞、无细胞体系或其他翻译体系中制备的依赖性细小病毒颗粒，其中该细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含编码依赖性细小病毒的核酸，该依赖性细小病毒包含如本文所提供的衣壳变体。
16、在一些实施例中，本公开部分地涉及一种治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括以有效治疗疾病或病症的量向受试者施用本文所述的依赖性细小病毒颗粒。
17、进一步参考以下编号的实施例描述本发明。
1.一种变体衣壳多肽，其包含与seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的vp1、vp2或vp3序列具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％同一性的多肽。
2.根据权利要求1所述的变体衣壳多肽，其中变体是与seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的多肽(aav2)相同的血清型。
3.根据权利要求1所述的变体衣壳多肽，其中变体与seq id no:2、seq id no:3或seqid no:4的多肽(aav2)相比是不同的血清型。
4.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述多肽包含seq id no:1的变体，其中所述变体衣壳多肽包含对应于在与seq id no:1相比的585、586、587、588、589、590、591、593、597、600、608中的一个或多个位置处的突变的突变，任选地其中所述突变包括插入、缺失或取代。
5.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含：
6.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含对应于在与seq id no:1相比的位置585、588、589、590、593、597和608处的突变的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或所有突变)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含对应于在与seq id no:1相比的位置585、586、587、588、589、590、591、593和600处的突变的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或所有突变)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含对应于在与seq id no:1相比的位置585、588、590、591和597处的突变的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个或所有突变)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含与seq idno:1相比的r585v、r588t、q589g、a590p、a593g、t597i和d608n中的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或所有突变)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含与seqid no:1相比的r585s、g586s、n587i、r588t、q589a、a590p、a591g、a593g和v600c中的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或所有突变)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含与seqid no:1相比的r585n、r588t、a590p、a591t和t597h中的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个或所有突变)。
12.一种变体衣壳多肽，其包含：(a)以下中任一者的多肽：seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4；(b)以下中任一者的vp2或vp3序列：seq id no:2、seq id no:3或seq idno:4；(c)包含与其(例如，与(a)或(b)的多肽)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列的多肽，其中相对于seq id no:1，所述多肽包含与seq id no:2至seq id no:4中任一者相关的突变中的至少一者(例如，一者、两者、三者或更多者，例如全部)；或(d)相对于(a)或(b)的所述多肽，具有至少1个、但不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过3个或不超过2个氨基酸突变的多肽，其中相对于seq id no:1，所述多肽包含与seq id no:2至seq id no:4中任一者相关的突变中的至少一者(例如，一者、两者、三者或更多者，例如全部)。
13.一种包含vp1、vp2或vp3或其任意组合的变体衣壳多肽，其各自与seq id no:2、seqid no:3或seq id no:4的多肽至少或约95％、96％、97％、98％或99％相同，并且包含var-1至var-3中的任一者的所有突变差异。
14.一种包含vp1、vp2或vp3或其任意组合的变体衣壳多肽，其各自具有与seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的多肽相比的约1至约20个突变，并且包含var-1至var-3中的任一者的所有突变差异。
15.一种包含vp1、vp2或vp3或其任意组合的变体衣壳多肽，其各自具有与seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的多肽相比的约1至约10个突变，并且包含var-1至var-3中的任一者的所有突变差异。
16.一种包含vp1、vp2或vp3或其任意组合的变体衣壳多肽，其各自具有与seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的多肽相比的约1至约5个突变，并且包含var-1至var-3中的任一者的所有突变差异。
17.一种变体衣壳多肽，其包含seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的vp1、vp2或vp3序列。
18.一种变体衣壳多肽，其由seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4的vp1、vp2或vp3序列组成。
19.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述变体衣壳多肽为vp1多肽、vp2多肽或vp3多肽。
20.一种核酸分子，其编码根据权利要求1至19中任一项所述的变体衣壳多肽。
21.根据权利要求20所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含seq id no:5、6、7的序列，其片段，或其与其具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的变体。
22.根据权利要求21所述的核酸分子，其中所述其片段编码vp2衣壳多肽或vp3衣壳多肽。
23.一种病毒颗粒(例如，腺相关病毒(“aav”)颗粒)，其包含根据权利要求1至19中任一项所述的或由根据权利要求20至22中任一项所述的核酸分子编码的变体衣壳多肽。
24.根据权利要求23所述的病毒颗粒，其包含核酸，所述核酸包含有效载荷(例如，异源转基因)和一个或多个调控元件。
25.根据权利要求23至24中任一项所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒相对于野生型aav2(例如，包含seq id no:1的或由seq id no:8编码的衣壳多肽的病毒颗粒)表现出增加的眼部转导，例如，如在小鼠或在nhp中测量的，例如，如本文所述。
26.根据权利要求25所述的病毒颗粒，其中所述增加的眼部转导是增加的视网膜转导。
27.根据权利要求25至26中任一项所述的病毒颗粒，其中在全身性、例如静脉内施用后表现出所述增加的眼部转导。
28.根据权利要求20至22中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是双链或单链的，并且其中所述核酸分子是线性或环状的，例如其中所述核酸分子为质粒。
29.一种产生包含变体衣壳多肽的病毒颗粒的方法，所述方法包括将根据权利要求20至22或28中任一项所述的核酸分子引入细胞(例如hek293细胞)中，以及从中收获所述病毒颗粒。
30.一种将有效载荷(例如，核酸)递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与(a)包含根据权利要求1至19中任一项所述的变体衣壳多肽和有效载荷的依赖性细小病毒颗粒，或(b)根据权利要求24至27中任一项所述的病毒颗粒接触。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述细胞是眼部细胞。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述眼部细胞位于视网膜中。
33.一种将有效载荷(例如，核酸)递送至受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含根据权利要求1至19中任一项所述的变体衣壳多肽和所述有效载荷的依赖性细小病毒颗粒，或向所述受试者施用根据权利要求24至27中任一项所述的病毒颗粒。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述病毒颗粒将所述有效载荷递送至眼睛。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述病毒颗粒将所述有效载荷递送至视网膜。
36.根据权利要求30至35中任一项所述的方法，其中所述病毒颗粒通过全身性、例如静脉内施用，或通过直接至眼动脉的静脉内施用进行施用。
37.根据权利要求1至19中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求33至37中任一项所述的病毒颗粒或根据权利要求30至36中任一项所述的方法，其中所述病毒颗粒(例如，包含所述变体衣壳多肽的所述病毒颗粒)与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在眼睛的一个或多个区域中以增加的转导将所述有效载荷递送至所述眼睛。
38.根据权利要求37所述的变体衣壳多肽、病毒颗粒或方法，其中所述眼睛的所述一个或多个区域是视网膜，并且其中所述视网膜包括非黄斑视网膜。
39.根据权利要求1至19中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求23至27中任一项所述的病毒颗粒或根据权利要求30至36中任一项所述的方法，其中所述病毒颗粒(例如，包含所述变体衣壳多肽的所述病毒颗粒)与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在眼睛的一个或多个区域中以增加的转导将所述有效载荷递送至所述眼睛，并且其中与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，转导的增加是至少2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、150倍、200倍或250倍。
40.根据权利要求1至19中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求23至27中任一项所述的病毒颗粒或根据权利要求30至36中任一项所述的方法，其中所述病毒颗粒(例如，包含所述变体衣壳多肽的所述病毒颗粒)与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在眼睛的一个或多个区域中以增加的转导特异性将所述有效载荷递送至所述眼睛，其中与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，转导的增加是至少2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、500倍或1000倍，并且其中所述转导的增加对于非黄斑视网膜是特异性的。
41.根据权利要求29至40中任一项所述的变体衣壳多肽、病毒颗粒或方法，其中向所述受试者的施用是经由全身性、例如静脉内注射，或通过直接至眼动脉的静脉内施用进行的。
42.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括以有效治疗所述疾病或病症的量向所述受试者施用依赖性细小病毒颗粒，其中所述依赖性细小病毒颗粒是包含根据权利要求1至19中任一项所述的或由根据权利要求20至21或28中任一项所述的核酸编码的衣壳多肽的病毒颗粒，或是根据权利要求23至27中任一项所述的病毒颗粒。
43.一种治疗受试者的cns和/或眼部疾病或病症的方法，所述方法包括以有效治疗所述疾病或病症的量向所述受试者施用依赖性细小病毒颗粒，其中所述依赖性细小病毒颗粒是包含根据权利要求1至19中任一项所述的或由根据权利要求20至21或28中任一项所述的核酸编码的衣壳多肽的病毒颗粒，或是根据权利要求23至27中任一项所述的病毒颗粒，任选地其中所述疾病或病症是神经元蜡样质脂褐质沉积症(ncl)。
44.一种细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含根据权利要求1至27或37至41中任一项所述的衣壳多肽、核酸分子或病毒颗粒。
45.一种制备依赖性细小病毒(例如，腺相关依赖性细小病毒(aav)颗粒的方法，所述方法包括：
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含第二核酸分子，并且所述第二核酸分子被包装在所述依赖性细小病毒颗粒中，并且其中所述第二核酸包含有效载荷，例如，编码治疗产品的异源核酸序列。
47.根据权利要求45至46中任一项所述的方法，其中根据权利要求20至22或38中任一项所述的核酸介导依赖性细小病毒颗粒的产生，所述依赖性细小病毒颗粒不包含根据权利要求20至22或28中任一项所述的核酸。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中根据权利要求20至22或38中任一项所述的核酸以由编码seq id no:1的核酸分子介导的生产水平的至少10％、至少20％、至少50％或至少100％的水平，或者相比由编码seq id no:1的核酸分子介导的生产水平高至少10％、高至少20％、高至少50％或高至少100％的水平，来介导依赖性细小病毒颗粒的产生。
49.一种组合物，例如药物组合物，其包含根据权利要求23至27或37至41中任一项所述的病毒颗粒或通过根据权利要求29或45至48中任一项所述的方法产生的病毒颗粒，以及药学上可接受的载体。
50.根据权利要求1至19中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求20至22或28中任一项所述的核酸分子、或根据权利要求23至27或37至41中任一项所述的病毒颗粒，其用于治疗受试者的疾病或病症。
51.根据权利要求1至19中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求20至22或28中任一项所述的核酸分子、或根据权利要求23至27或37至41中任一项所述的病毒颗粒，其用于制造用于治疗受试者的疾病或病症的药物。
